DNA組換え：定義、段階、原則、プロセスおよび機能

June 28, 2021
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クイックリードリスト公演

1.DNA組換えとは何ですか？

2.DNA組換えの歴史

3.DNA組換え法のプロセス

3.1.DNA変換法

3.2.DNA形質導入法

3.3.DNAコンジュゲーション法

4.組換えDNA技術

5.組換えDNA技術

6.DNA組換え段階

6.1.1. DNAソースの分離

6.2.2. 遺伝子切断

6.3.3. 遺伝子合併

6.4.4. 細菌への遺伝子挿入

6.5.5. 組換えDNAを標的細胞に挿入する

7.組換えDNAの用途と利点

8.組換えDNAの機能

9.プラスミド

9.1.これを共有：

9.2.関連記事：

DNA組換えとは何ですか？

DNA組換え（rDNA）は、生物からのDNAを細菌のDNAに入れる試みです。通常はスプライシングでは一緒に発生しない2つ以上の配列を組み合わせる遺伝子。遺伝子組み換えの場合、関連するDNAを生物の既存のDNAに導入することで作成されますプラスミドやバクテリアなど、耐性などの特定の目的のためにさまざまな特性をコード化または変更する抗生物質。遺伝子組換えとは異なり、細胞内では発生しませんが、操作されます。組換えタンパク質は、組換えDNAから生成されるタンパク質です。

植物学における組換えDNAの最初の使用の1つでは、多くの植物が十分なゲノムを持っています彼らが遠くの種からのDNAを容易に組み込むことを可能にする適応関連。科学者たちは、新しい遺伝子をスプライシングすることで、干ばつや熱などの極端な環境条件に耐性のある植物を開発することができました。

この場合、組換えDNAを使用して特定の動物から遺伝子を取得し、既存のゲノムでスプライスすることもできます。さまざまな害虫を食欲をそそる化学物質を含む植物を作るためのいくつかの植物と寄生虫。

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DNA組換えの歴史

組換えDNA技術は、大学院生のPeterLobbanによって最初に提案されました。組換えDNA技術の活用は、制限エンドヌクレアーゼの単離、発見、および適用によって促進されました。 1978年ノーベル賞を受賞したヴェルナーアーバー、ダニエルネイサンズ、ハミルトンスミス医療。組換えDNA技術の応用におけるブレークスルーは、1977年にハーバートボイヤーが実験室でヒト生合成インスリンを製造したときに起こりました。ヒトにおけるインスリン産生をコードする特定の遺伝子配列またはポリヌクレオチドが、E.coli細菌のサンプルコロニーに導入された。これは、組換えDNA技術によって製造され、FDAによって承認された最初の薬剤であり、humulinというブランド名で市販されています。現在世界中で使用されているインスリンのほとんどは、現在、生合成組換えヒトインスリンまたはその類似体です。

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DNA組換え法のプロセス

DNA組換えで使用される方法は次のとおりです。

DNA変換法

DNAを細菌細胞に挿入する方法です。この形質転換法は、DNAが遺伝物質であるという事実につながる遺伝形質を伝達するために最初に開発されました。形質転換は様々な生物の遺伝子連鎖を研究するために利用されてきましたが、この方法は現在、小さなプラスミドをある細菌株から別の細菌株に移すために広く使用されていますその他。形質転換の原理は、ドナー細胞からDNAを抽出し、それをレシピエント細胞と混合することです。壁や膜の細孔やチャネルからDNA分子が侵入しやすくなっている細胞。入ってくるDNA分子がプラスミドの場合、形質転換中に新しい宿主ゲノムでプラスミド複製が可能になります。

変換方法の3つの重要な要素が必要です。

安定したホスト
自分自身を複製するにはベクトルが必要です
挿入可能な遺伝子とともに挿入可能な宿主細胞の選択が必要

DNA形質導入法

ファージ（ウイルスに含まれるバクテリオファージラムダの誘導体）を挿入することによる遺伝子トランスフェクションプロセスであるか、または形質転換プロセスとほぼ同じです。

DNAコンジュゲーション法

外来遺伝子を宿主DNAまたは人工染色体（BAC）に組み込む方法です。コンジュゲートプラスミドの基礎は次のとおりです。

細菌に標的細菌との結合プロセスを開始できるようにするのは、エピソーム細菌DNAのごく一部です。
クローニング制限= 75 –300kb。

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組換えDNA技術

組換えDNA技術を理解し、 古典的に、ほとんどの生物からのタンパク質や他の材料の分子分析は、それらを大量に精製することが難しいため、非常に簡単ではありません。しかし、1970年代以降、これらの問題を克服するためのアプローチとして適用できる技術が開発されました。特定のタンパク質の発現または生成物の形成に関与する遺伝子の単離および操作を介して。

として知られている技術 組換えDNA技術、またはより一般的な用語で 遺伝子操作、これは、自然の細胞ではない細胞で特定の遺伝子を複製しようとすることを含むので、それはしばしばと呼ばれます 遺伝子クローニング. 組換えDNA技術の意味を説明するために多くの定義が与えられています。おそらく最も代表的なものの1つは、組換えDNA技術は、 DNA分子をベクターに挿入して、細胞として機能する別の生物の細胞に統合および増殖できるようにするホスト。

組換えDNA技術には2つの利点があります。まず、各遺伝子を分離して研究することにより、その機能と制御メカニズムに関する知識が得られます。第二に、この技術により、特定の遺伝子産物を従来の生産よりも迅速かつ大量に生産することができます。

基本的に、組換えDNA技術を介して目的の製品を取得するための取り組みには、いくつかの特定の段階が含まれます（図9.1）。これらのステップは、クローン化されるゲノム/染色体DNAの分離、DNA分子をさまざまなサイズのいくつかのフラグメントに切断すること、ベクターDNAの分離、DNAフラグメントの挿入です。組換えDNA分子を生産するためのベクターへの変換、組換えDNA分子を使用した宿主細胞の形質転換、宿主細胞からの組換えDNA分子の再単離、および組換えDNAの分析。

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組換えDNA技術

組換えDNA技術により、次のことが可能になりました。さまざまな生物からDNAを分離し、さまざまな生物からDNAを組み合わせて、組換えDNAが形成され、原核生物と真核生物の細胞に組換えDNAを挿入することで、組換えDNAを複製し、さらには複製することができます。表現された。したがって、組換えDNAテクノロジーは、試験管内で遺伝子を組み合わせるために使用される技術または方法のコレクションです。

これらの手法は次のとおりです。

DNAを分離するための技術
DNAを切断するための技術
DNAを結合またはスプライシングするための技術
DNAを生細胞に挿入する技術

組換えDNA技術で使用されるデバイスはバクテリアのものです。これらのツールには、制限酵素、DNAリガーゼ酵素、プラスミド、トランスポゾン、ゲノムライブラリー、逆転写酵素、トレーサーが含まれます。 DNA / RNA。

細菌プラスミドまたはウイルスDNAウイルスの形のベクター。
バクテリアは、バクテリアの伝播を通してプラスミドの伝播に役割を果たします。
制限酵素（プラスミド/ DNAカッター）とリガーゼ酵素（DNA断片を接続する）からなる酵素

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DNA組換え段階

組換えDNA技術には、DNAの単離、DNAの切断、結合などの技術が含まれます。組換えDNAが複製できるようにDNAをスプライシングし、生細胞にDNAを挿入する技術表現された。 Moeljopawiroに従って組換えDNAを作成する手順は次のとおりです。

1. DNAソースの分離

単一のDNAフラグメントの溶出または単離は、不純物DNAフラグメントの混合物から標的DNAフラグメントを分離するプロセスです。これらのフラグメントは他のDNA遺伝子を検出するためのトレーサーに使用でき、他のDNAフラグメントに移植できるため、これは遺伝子工学において重要です。他のDNAフラグメントと混合されていないDNAフラグメントは、いくつかの段階を経て取得されます。

最初の段階は、切断して他のフラグメントから分離したいフラグメントを分離することです。制限酵素またはPCRの結果を使用した後、ゲルを使用して電気泳動を行いますアガロース。次のステップは、分離するフラグメントを検出し、フラグメントを含むアガロースゲルを切断することです。最後のステップは、中性のHybon Nメンブレンを通過させ、Trisバッファーとドデシル硫酸ナトリウムを含む溶出バッファー溶液を与えることにより、アガロースゲルからDNAフラグメントを分離することでした。

2. 遺伝子切断

プラスミド制限は、制限酵素を使用して、必要に応じて特定の部位でDNAフラグメントを切断するプロセスです。組換えDNA分子は、2種類の酵素、つまり特定の部位でDNAを切断する「はさみ」として機能する制限エンドヌクレアーゼ酵素がないと簡単に作成できません。各制限酵素は特定の配列を認識し、その塩基配列の特定の場所でのみ切断します。制限酵素は、1つのデオキシリボヌクレオチドのリン酸と隣接するデオキシリボヌクレオチドの糖との間の共有結合を切断することにより、DNA二本鎖を切断します。

切断結果には、フラットエンド（平滑末端）と粘着エンド（粘着末端）の2種類があります。平滑末端は、分子の2つの鎖が同じ位置で切断され、末端が均一で、対になっていないヌクレオチドがない場合に生成されます。各DNA分子が不均等な位置で切断され、鎖の1つ（5 'または3'）がいくつかのヌクレオチドでぶら下がると、凝集末端（粘着末端）が生成されます。これらの不均一な一本鎖の末端は、対になった塩基と自発的に対になる可能性があるため、「粘着性」または凝集性と呼ばれます。

3. 遺伝子合併

ライゲーションは、あるDNAフラグメントを別のDNAフラグメントに結合するプロセスです。遺伝子クローニングでは、インサートDNAがクローニングベクターとスプライシングされます。プラスミド、ファージ、コスミドなどの細菌用ベクターや、生物に使用される他のいくつかのベクターなど、いくつかの種類のベクターがあります。細菌に加えて、すなわち酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、植物クローニングベクターおよび哺乳類細胞ベクター（Barnum、 2005).

結紮プロセスで最も重要な要素はリガーゼ酵素です。結合する両端が相補的である場合、ライゲーションは成功します。スプライシングされるDNAフラグメントの末端が不均一（粘着末端）である場合は、非常に特異的な一致が必要です終了）、スプライシングはシャルガフの法則に従う必要があるため、つまり、TペアとA、Gペアと C。一方、フラットエンド（平滑末端）を持つDNAフラグメントは、フラットエンドを持つ他のDNAフラグメントとスプライスすることができます。したがって、不均一な末端を使用して特定のDNAフラグメントをクローン化する一方、特定の仕様を必要としないDNAクローニングは、フラットエンドを使用します（Suharsono、2000）。

4. 細菌への遺伝子挿入

遺伝子の挿入は、次の2つの方法で行うことができます。

接合：1つの細胞（ドナー細胞）から別の細菌細胞へのDNAの移動
（受信セル）2つのセル間の物理的接触を介して
形質転換：周囲の環境からバクテリアがDNAを取り込むこと。
形質導入：ある細胞から別の細胞へのDNAの移動
ファージ中間体。

細菌に侵入するDNAは、細菌のDNAまたは染色体と統合して、組換えDNAまたは組換え染色体を形成することができます。切断から結合までのDNA組換えプロセスを次の図に示します。

5. 組換えDNAを標的細胞に挿入する

組換えDNAを標的細胞/生細胞に挿入するには、次の3つの方法があります。

形質転換：周囲の環境から組換えDNAを採取します。
DNAパッケージング：DNAファージ分子をファージ粒子に挿入します。
ミンクロインジェクション：超小型の針を使用して、組換えDNAを形質転換細胞の核に直接注入します。

組換えDNAを標的細胞、例えば植物に入力するプロセスは、次のように示すことができます。

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組換えDNAの用途と利点

組換えDNA技術は、健康、農業、海洋、法律、科学の分野で日常生活に広く適用されています。以下は、生活のいくつかの分野における組換えDNA技術の応用と利点の例です。

健康
a。ヒトインスリンは、大腸菌を使用して大量生産されており、糖尿病の治療に取引されています。
b。 B型肝炎ワクチンは、肝炎ウイルスの感染を防ぐために使用されます。 S.cereviciaeを工業規模で使用して商業的に生産されているc。ヒト成長ホルモン（GH）は、E.coliを使用して生成され、成長障害（ミゼットなど）の治療に使用されます。
d。病気の遺伝子治療は、損傷した遺伝子を、病気の治療に使用される正常な遺伝子に置き換えることによって行われます。遺伝子の欠陥によって引き起こされる遺伝性疾患やその他の病気を治療します（例：癌）
農業
a。氷-バクテリア（アイスマイナス）：低温で凍結しないように設計されたバクテリア。冬に植物が凍らないように、植物に使用（スプレー）します。
b。廃棄物を分解する微生物。
c。害虫に強い作物、例：Bt綿、Btトマト
d。除草剤耐性植物。
マリンフィールド：魚のサイズを大きくするための成長ホルモンの使用
法の分野
a。犯罪者は、たとえば次のようなDNAフィンガープリント分析を使用して特定できます。レイプ事件
b。 DNAフィンガープリントに基づいて祖先と家族を決定します。
科学の分野
a。乳がんなどの人間の異常（遺伝病）の発生を理解するための取り組みを支援する
b。 DNA技術の進歩により、科学者（科学者の国際コンソーシアム）はヒトゲノムプロジェクトや他の生物のゲノムを実現するようになりました。

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組換えDNAの機能

組換えDNAを介したワクチンの投与においても可能であり、このワクチンを作成するために、ヘルペスウイルス、そのDNAは除去され、病気の抗体を作るためのコーディングを含む組換えDNAで満たされています確かに。

この技術は比較的新しいものですが、非常に成功していることが証明されており、科学者はそれが現在利用できないさまざまな病気のワクチンを作るためにさらに開発することができますそれを持っている。組換えDNA技術を使用していくつかの病気の患者を治療することも可能です。損傷したDNA配列によって引き起こされる多くの状態があり、通常はウイルス送達を介して患者に与えられるDNAの健康な部分に置き換えることができます。

研究では、嚢胞性線維症や鎌状赤血球貧血などの病気は、人のDNAの構造変化によって、いつの日か治療および予防できる可能性があることが示唆されています。この病気を治す技術はまだ開発中ですが、初期の結果は有望です。

特定の酵素の必要性を認識または認識しているDNA配列を持たない患者では、組換えDNA治療の恩恵を受けることもできます。この場合、特定のタスクを実行するために必要な特別なタンパク質を作成するDNA鎖を人のDNAに挿入することができます。多くの種類の条件では、新しいDNAは通常の鎖にしか付着できないため、損傷したDNAの部分を組換えDNAで置き換える必要はありません。インスリンを服用している糖尿病患者には、このタイプの技術を使用してインスリンが生成されるため、このような組換えDNA技術を使用してください。

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プラスミド

一般に、プラスミドは、自己複製できる染色体の外側の二本鎖環状DNA分子として定義できます。プラスミドは、さまざまなサイズの原核生物に広く分布しています. プラスミドは小さな環状物質とも呼ばれ、細菌に見られる染色体外DNA分子であり、宿主細胞の外で複製することができます。プラスミドの増殖速度は速く、クローン化する能力の限界は0.1〜10kbです。導入遺伝子のみを含むプラスミドは、マージプロセスを開始するのに役立ちます。

プラスミドは、耐性プラスミド、コールドプラスミド、破壊プラスミド、および毒性プラスミドに分けることができます。

耐性プラスミド
つまり、遺伝子のみを含み、抗生物質/毒物に対する耐性のみを引き起こすことができるプラスミド。
コールドプラスミド
これは、バクテリアを殺すことができるタンパク質であるコリンなど、生産を決定するためのコードを含む遺伝子を含むプラスミドです。
分解プラスミド
すなわち、特定の物質、例えば、トゥール、唾液腺などを切断することができるプラスミド。
毒性プラスミド。
これらは病原菌に見られるプラスミドです。たとえば、サルモネラ菌では、病気を引き起こす可能性があります。