DNA rekombinatsioon: määratlus, etapid, põhimõtted, protsessid ja funktsioonid
Mis on DNA rekombinatsioon?
DNA rekombinatsioon (rDNA) on katse viia organismist pärinev DNA bakteriaalse DNA-le kahe või enama järjestuse kombineerimine, mis splaissimise teel tavaliselt ei esine geen. Geneetilise muundamise korral luuakse see vastava DNA viimisega organismi olemasolevasse DNA-sse nagu plasmiidid ja bakterid, erinevate omaduste kodeerimiseks või muutmiseks konkreetsel eesmärgil, näiteks resistentsus antibiootikumid. See erineb geneetilisest rekombinatsioonist selle poolest, et see ei toimu rakusiseselt, vaid on konstrueeritud. Rekombinantne valk on rekombinantsest DNA-st toodetud valk.
Rekombinantse DNA ühes esimeses kasutuses botaanikas on paljudel taimedel piisavalt genoome kohandused, mis võimaldavad neil hõlpsasti kaasata kaugete liikide DNA-d seotud. Uue geeni splaissimisega on teadlased suutnud välja töötada taimi, mis on vastupidavad ekstreemsetele keskkonnatingimustele, sealhulgas põudale ja kuumusele.
Sel juhul on võimalik kasutada ka rekombinantset DNA-d kindla looma geenide võtmiseks ja olemasoleva genoomi splaissimiseks mõned taimed taimede valmistamiseks, mis sisaldavad kemikaale, mis muudavad need kahjurite hävitamiseks ja parasiit.
Loe ka artikleid, mis võivad olla seotud: Semikonservatiivne DNA replikatsioon - määratlus, komponendid, mudel, dispersiivne, eksperdid
DNA rekombinatsiooni ajalugu
Rekombinantse DNA tehnika pakkus esmakordselt välja aspirant Peter Lobban. Rekombinantse DNA tehnoloogia kasutamist hõlbustas restriktsiooni endonukleaaside eraldamine, avastamine ja rakendamine Aastal Werner Arber, Daniel Nathans ja Hamilton Smith, kellele nad said 1978. aastal Nobeli preemia meditsiiniline. Rekombinantse DNA tehnoloogia rakendamisel toimus läbimurre 1977. aastal, kui Herbert Boyer laboris inimese biosünteetilise insuliini tootmisel. Spetsiifilised geenijärjestused või polünukleotiidid, mis kodeerivad inimestel insuliini tootmist, viiakse E. coli bakteri proovikolooniasse. See on esimene rekombinantse DNA tehnoloogia abil valmistatud ravim, mille FDA on heaks kiitnud ja mis on kaubanduslikult saadaval kaubamärgi all humulin. Enamik kogu maailmas praegu kasutatavast insuliinist on nüüd biosünteetiline rekombinantne iniminsuliin või selle analoogid.
Loe ka artikleid, mis võivad olla seotud: Mükoplasmabakterite omadused bioloogias
DNA rekombinatsioonimeetodi protsess
DNA rekombinatsioonis kasutatavad meetodid hõlmavad järgmist:
DNA muundamise meetod
See on meetod DNA sisestamiseks bakterirakkudesse. See transformatsioonimeetod töötati esmakordselt välja geneetiliste tunnuste ülekandmiseks, mis viis selleni, et DNA on geneetiline materjal. Kuigi transformatsiooni on kasutatud geenide seose uurimiseks erinevates organismides, on see meetod kasutatakse nüüd laialdaselt väikeste plasmiidide ülekandmiseks ühest bakteritüvest teise muud. Transformatsiooni põhimõte on doonorrakust DNA eraldamine, seejärel segamine retsipientrakuga mis on muudetud vastuvõtlikuks DNA molekulide sisenemisele seintes ja membraanides olevate pooride või kanalite kaudu kamber. Kui sissetulev DNA molekul on plasmiid, saab transformatsiooni käigus plasmiidi replikatsiooni uue peremeesgenoomiga võimaldada.
See võtab ümberkujundamismeetodi kolm põhielementi:
- Stabiilne peremees
- Vajab vektorit, et ennast korrata
- Nõuab peremeesraku valimist, mida saab sisestada sisestatava geeniga
DNA ülekandemeetod
Kas geeni transfektsiooniprotsess faagide (viirustes sisalduvate bakterioofaagi lambda derivaatide) sisestamise teel on peaaegu sama, mis transformatsiooniprotsess.
DNA konjugatsioonimeetod
Kas meetod võõraste geenide integreerimiseks peremeesorganismi DNA-sse või bakterite kunstlikesse kromosoomidesse (BAC). Konjugaatplasmiidi alus on:
- On väike osa bakteriaalse episomaalse DNA osast, mis annab bakteri sihtbakteritega liitumisprotsessi algatamiseks.
- Kloonimispiir = 75 - 300 kb.
Loe ka artikleid, mis võivad olla seotud: Geenimutatsioonide põhjused - määratlus, looduslikud, tehislikud, tegurid, tüübid, mehhanismid, tagajärjed
Rekombinantne DNA tehnoloogia
Rekombinantse DNA tehnoloogia mõistmine, Klassikaliselt ei ole enamiku organismide valkude ja muude materjalide molekulaarset analüüsi lihtne teha, kuna neid on raske suurtes kogustes puhastada. Kuid alates 1970. aastatest on välja töötatud tehnoloogia, mida saab kasutada probleemide ületamiseks konkreetse valgu ekspressiooni või toote moodustumise eest vastutava geeni eraldamise ja manipuleerimise kaudu.
Tehnoloogia, mida nimetatakse rekombinantse DNA tehnoloogia abilvõi populaarsemates terminites geneetiline manipuleerimine, see hõlmab teatud geenide paljunemist rakus, mis ei ole looduslik rakk, nii et sellele viidatakse sageli ka geenide kloonimine. Rekombinantse DNA tehnoloogia tähenduse kirjeldamiseks on antud palju määratlusi. Üks neist, mis on võib-olla kõige esinduslikum, väidab, et rekombinantne DNA tehnoloogia on geneetilise materjali uute kombinatsioonide moodustamine DNA molekuli sisestamine vektorisse, et see saaks integreeruda ja paljuneda rakuna toimiva teise organismi rakus peremees.
Rekombinantse DNA tehnoloogial on kaks eelist. Esiteks saadakse iga geeni isoleerides ja uurides teadmised selle funktsioonist ja kontrollimehhanismist. Teiseks võimaldab see tehnoloogia teatud geeniprodukte toota kiiremini ja suuremates kogustes kui tavapärane tootmine.
Põhimõtteliselt on püüd rekombinantse DNA tehnoloogia abil saada soovitud saadust mitme kindla etapiga (joonis 9.1). Need etapid on kloonitava genoomse / kromosoomse DNA eraldamine, DNA molekulide lõikamine mitmeks erineva suurusega fragmendiks, vektori DNA eraldamine, DNA fragmentide sisestamine. vektoriteks rekombinantsete DNA molekulide tootmiseks, peremeesrakkude transformeerimine rekombinantsete DNA molekulide abil, rekombinantsete DNA molekulide uuesti eraldamine peremeesrakkudest ja rekombinantse DNA analüüs.
Loe ka artikleid, mis võivad olla seotud: DNA määratlus ning selle funktsioon, struktuur ja kasutamine tehnoloogias
Rekombinantne DNA tehnika
Rekombinantse DNA tehnoloogia on võimaldanud meil: isoleerida DNA erinevatest organismidest, ühendada erinevate organismide DNA nii moodustub rekombinantne DNA, sisestades rekombinantse DNA prokarüootsete ja eukarüootsete organismide rakkudesse, et rekombinantne DNA saaks paljuneda ja isegi väljendas. Niisiis, rekombinantse DNA tehnoloogia on tehnikate või meetodite kogum, mida kasutatakse geenide ühendamiseks katseklaasides.
Need tehnikad hõlmavad järgmist:
- DNA eraldamise tehnikad
- DNA lõikamise tehnikad
- DNA ühendamise või ühendamise tehnikad
- Tehnikad DNA sisestamiseks elusrakkudesse
Rekombinantse DNA tehnoloogias kasutatakse seadmeid bakterites. Nende seadmete hulka kuuluvad: restriktsiooniensüümid, DNA ligaasi ensüümid, plasmiidid, transposonid, genoomi raamatukogud, pöördtranskriptsiooni ensüümid, märgistusained DNA / RNA.
- Vektor bakteriaalse plasmiidi või viiruse DNA viiruse kujul.
-
Bakterid mängivad rolli plasmiidide paljundamisel bakterite paljundamise kaudu.
-
Ensüümid, mis koosnevad RESTRICTION ensüümidest (plasmiidi / DNA lõikurid) ja Ligaasi ensüümidest (ühendavad DNA tükid)
Loe ka artikleid, mis võivad olla seotud: Koensüümi ja kofaktori erinevus bioloogias
DNA rekombinatsioonietapid
Rekombinantse DNA tehnoloogia hõlmab mitut tehnikat, sealhulgas tehnikaid DNA eraldamiseks, DNA lõikamiseks, kombineerimiseks / DNA splaissimine ja meetodid DNA sisestamiseks elusrakkudesse, et rekombinantne DNA saaks paljuneda ja väljendas. Rekombinantse DNA valmistamise etapid Moeljopawiro järgi on järgmised:
1. DNA allika eraldamine
Üksikute DNA fragmentide elueerimine või eraldamine on protsess, mille käigus eraldatakse sihtmärk-DNA fragmendid lisandite DNA fragmentide segust. See on oluline geenitehnoloogias, kuna neid fragmente saab kasutada märgistusainetena teiste DNA geenide tuvastamiseks ja neid saab pookida teistele DNA fragmentidele. DNA fragmendid, mida ei ole segatud teiste DNA fragmentidega, saadakse mitmel etapil.
Esimene etapp on fragmendi eraldamine lõigates teistest fragmentidest kasutades restriktsiooniensüüme või PCR tulemusi, millele järgneb elektroforees geeli abil agaroos. Järgmine samm on eraldatava fragmendi tuvastamine ja fragmenti sisaldava agaroosgeeli lõikamine. Viimane samm oli DNA fragmentide eraldamine agaroosgeelist, viies selle läbi neutraalse Hybon N membraani ja saades elueerimispuhvri lahuse, mis sisaldas Tris-puhvrit ja naatriumdodetsüülsulfaati.
2. Geenilõikus
Plasmiidi restriktsioon on DNA fragmentide lõikamine teatud kohtades vastavalt soovile, kasutades restriktsiooniensüüme. Rekombinantseid DNA molekule ei saa hõlpsasti valmistada ilma kahte tüüpi ensüümide olemasolu, nimelt: restriktsiooni endonukleaasi ensüümid, mis toimivad "kääridena" DNA lõikamiseks teatud kohtades. Iga restriktsiooniensüüm tunneb ära kindla järjestuse ja lõhub ainult selle aluse järjestuse teatud kohtades. Piiravad ensüümid lõikavad DNA topeltahelad, purustades kovalentse sideme ühe deoksüribonukleotiidi fosfaadi ja külgneva deoksüribonukleotiidi suhkru vahel.
Lõiketulemusi on kahte tüüpi: lame ots (nüri ots) ja siduv ots (kleepuv ots). Nürid otsad tekivad siis, kui molekuli kaks ahelat lõigatakse samas asendis, otsad on ühtlased ja paardumata nukleotiide pole. Kohesioonne ots (kleepuv ots) tekib siis, kui iga DNA molekul lõigatakse ebavõrdsetes kohtades nii, et üks ahelatest (5 'või 3') ripub mitme nukleotiidiga. Need ebaühtlased üheahelalised otsad võivad spontaanselt paaritud oma paaristatud alustega, nii et neid nimetatakse "kleepuvateks" või sidusateks.
3. Geenide ühinemine
Ligeerimine on ühe DNA fragmendi ühendamine teise DNA fragmendiga. Geenikloonimisel splaissitakse insert-DNA kloonimisvektoriga. Vektoreid on mitut tüüpi, sealhulgas bakterite vektorid, näiteks plasmiidid, faagid ja kosmiidid, samuti mitmed muud organismide jaoks kasutatavad vektorid. lisaks bakteritele, nimelt pärmi kunstlikud kromosoomid (YAC), bakterite kunstlikud kromosoomid (BAC), taimede kloonimisvektorid ja imetajarakkude vektorid (Barnum, 2005).
Ligeerimisprotsessi kõige olulisem tegur on ensüüm Ligaas. Ligeerimine on edukas, kui ühendatavad kaks otsa täiendavad teineteist. Kui splaissitaval DNA fragmendil on ebaühtlane (kleepuv) ots, on vajalik väga konkreetne vaste lõpp), sest splaissing peab toimuma Chargaffi reegli järgi, nimelt T-paarid A-ga ja G-paarid -ga C. Kui lameda otsaga (nüri otsaga) DNA fragmente saab ühendada mis tahes muu lameda otsaga DNA fragmendiga. Seetõttu kloonida konkreetne DNA fragment ebaühtlaste otste abil samas kui DNA kloonimine, mis ei vaja spetsifikatsioone, kasutab lamedaid otsi (Suharsono, 2000).
4. Geenide sisestamine bakteritesse
Geeni saab sisestada kahel viisil:
- Konjugatsioon: DNA ülekandmine ühest rakust (doonorrakust) teise bakterirakku
(vastuvõtjarakk) kahe raku füüsilise kontakti kaudu - Transformatsioon: bakterite poolt ümbritsevast keskkonnast DNA võtmine.
- Transduktsioon: DNA kandumine ühest rakust teise läbi
faagi vahe.
Bakteritesse sisenev DNA võib integreeruda bakteriaalse DNA või kromosoomidega, moodustades rekombinantse DNA või rekombinantse kromosoomi. DNA rekombinatsiooniprotsess lõikamisest liitmiseni on näidatud järgmisel joonisel:
5. Rekombinantse DNA sisestamine sihtrakkudesse
Rekombinantse DNA sisestamist sihtrakkudesse / elusrakkudesse saab teha kolmel viisil:
- Transformatsioon: rekombinantse DNA võtmine ümbritsevast keskkonnast.
- DNA-pakkimine: DNA-faagi molekulide sisestamine faagiosakestesse.
- Minikroneerimine: super-väikese nõelaga süstitakse rekombinantne DNA otse transformeeritud raku tuuma.
Rekombinantse DNA sisestamise protsessi märklaudrakkudesse, näiteks taimedes, saab näidata järgmiselt:
Loe ka artikleid, mis võivad olla seotud: Taimerakud: tüübid, osad, pildid ja funktsioonid on lõpule viidud
Rekombinantse DNA rakendused ja eelised
Rekombinantse DNA tehnoloogiat kasutatakse igapäevaelus laialdaselt tervise, põllumajanduse, mere, õiguse ja teaduse valdkonnas. Järgnevalt on toodud näited rekombinantse DNA tehnoloogia rakendustest ja eelistest mitmel elualal:
- Tervis
a. Iniminsuliini on toodetud massiliselt E.coli bakterite abil ja sellega on kaubeldud diabeedi raviks.
b. B-hepatiidi vaktsiini kasutatakse hepatiidiviirusega nakatumise vältimiseks. On toodetud kaubanduslikult, kasutades S. cereviciae tööstuslikus ulatuses c. Inimese kasvuhormooni (GH) toodetakse E.coli abil ja seda kasutatakse kasvuhäirete (nt kääbus) raviks.
d. Haiguste geeniteraapia toimub kahjustatud geenide asendamisel tavaliste geenidega, mida kasutatakse haiguste raviks pärilike haiguste (geneetiliste häirete) ja muude geenidefektidest põhjustatud haiguste (nt: vähk) -
Põllumajandus
a. Jääbakterid (jää miinus): bakterid, mis on konstrueeritud nii, et nad ei külmuks madalal temperatuuril. Kasutatakse (pihustatakse) taimedele, et taimed talvel ei külmuks.
b. jäätmeid lagundavad mikroobid.
c. Kahjuritele vastupidavad põllukultuurid, nt Bt puuvill, Bt tomatid
d. Herbitsiidikindlad taimed. -
Mereväli: kasvuhormooni kasutamine kala suuruse suurendamiseks
- Õiguse valdkond
a. Kurjategijaid saab tuvastada, kasutades näiteks DNA sõrmejälje analüüsi: vägistamisjuhtumid
b. Esivanemate ja perekonna määramine DNA sõrmejälgede põhjal. -
Teadusvaldkond
a. Aidates jõupingutusi mõista häirete esinemist inimestel (geneetilised haigused), näiteks rinnavähk
b. DNA-tehnoloogia areng on innustanud teadlasi (rahvusvaheline teadlaste konsortsium) mõistma inimese genoomiprojekti ja teiste organismide genoomi.
Loe ka artikleid, mis võivad olla seotud: Kromosomaalsete tüüpide seletus täieliku tsentromere põhjal
Rekombinantse DNA funktsioonid
Selle vaktsiini loomiseks on vaktsiinide manustamine võimalik ka rekombinantse DNA kaudu, näiteks peremeesviirus herpesviirus, selle DNA on eemaldatud ja täidetud rekombinantse DNA-ga, mis sisaldab kodeerimist haiguse antikehade saamiseks teatud.
Kuigi see tehnoloogia on suhteliselt uus, on see osutunud üsna edukaks ja teadlased loodavad, et see nii ka on saab edasi arendada, et valmistada vaktsiine mitmesuguste haiguste jaoks, mis praegu puuduvad on see olemas. Rekombinantse DNA tehnoloogia abil on võimalik ravida ka patsiente mitmest haigusest. Kahjustatud DNA järjestuste põhjustatud seisundid on paljud, mida saab asendada patsientidele manustatud DNA tervete osadega, tavaliselt viiruse kaudu.
Uuringute põhjal võib väita, et selliseid haigusi nagu tsüstiline fibroos ja sirprakuline aneemia võib ühel päeval ravida ja ennetada inimese DNA struktuurimuutuste kaudu. Selle haiguse ravimise tehnoloogia on veel väljatöötamisel, kuid varajased tulemused on paljutõotavad.
Patsientidel, kellel puudub DNA järjestus, mis tekitab konkreetse ensüümi vajaduse või tunnistab selle vajadust, võib kasu saada ka rekombinantne DNA-ravi. Sellisel juhul saab inimese DNA-sse sisestada DNA-ahela, mis loob konkreetse ülesande täitmiseks vajalikud spetsiaalsed valgud. Paljude haigusseisundite korral ei pea DNA kahjustatud osa asendama rekombinantse DNA-ga, kuna uut DNA-d saab kinnitada ainult normaalse ahela külge. Diabeedihaigetele, kes võtavad insuliini, kasutage sellist rekombinantse DNA tehnoloogiat, kuna insuliini toodetakse seda tüüpi tehnoloogia abil.
Loe ka artikleid, mis võivad olla seotud: Escherichia Coli - määratlus, klassifikatsioon, struktuur, tegurid, omadused, diagnoosimine, ravi
Plasmiid
Üldiselt võib plasmiidi määratleda kui kaheahelalist ümmargust DNA molekuli väljaspool kromosoomi, mis võib ise paljuneda. Plasmiide on laialt levinud erineva suurusega prokarüootsete organismide vahel. Plasmiide võib nimetada ka väikesteks ümmargusteks aineteks, need on ekstra kromosomaalsed DNA molekulid, mida leidub bakterites ja mis võivad paljuneda väljaspool peremeesrakku. Plasmiidi kasvukiirus on kiire ja selle kloonimisvõime piir on 0,1-10 kb. Ainult transgeene sisaldavad plasmiidid on ühinemisprotsessi algatamiseks.
Plasmiide võib jagada resistentseteks, külmadeks, destruktiivseteks ja virulentseteks plasmiidideks.
- Resistentne plasmiid
Nimelt plasmiidid, mis sisaldavad ainult geene ja võivad põhjustada resistentsust ainult anti-biotikumide / mürkide suhtes. - Külm plasmiid
See on plasmiid, mis sisaldab tootmise määramiseks koode sisaldavaid geene, näiteks koliini, valku, mis võib baktereid hävitada - Degradatiivne plasmiid
Nimelt plasmiidid, mis on võimelised lõikama konkreetset ainet, näiteks tooole, süljenäärmeid jne. - Virulentsed plasmiidid.
Need on patogeensetes bakterites leiduvad plasmiidid. Näiteks bakteris Salmonella võib see põhjustada haigusi.